質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)中的常規(guī)操作，通常分為以下主要步驟（以堿裂解法為例）：

1. 細(xì)菌培養(yǎng)與收集

培養(yǎng)：將含質(zhì)粒的細(xì)菌（如大腸桿菌）在選擇性培養(yǎng)基（如含抗生素的LB培養(yǎng)基）中培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD??? ≈ 0.6-0.8）。

收集：離心收集菌體（如12,000 rpm, 1分鐘），棄上清。

2. 菌體裂解

• 重懸：用緩沖液（如Solution I/懸浮緩沖液，含RNase）重懸菌體，打散沉淀。
• 裂解：加入堿裂解液（如Solution II，含NaOH和SDS），使細(xì)胞膜破裂，釋放質(zhì)粒和基因組DNA（此時溶液變黏稠透明）。
• 中和：加入中和緩沖液（如Solution III，含醋酸或高鹽），使DNA復(fù)性；質(zhì)粒因結(jié)構(gòu)小而迅速復(fù)性，而基因組DNA形成沉淀。

3. 去除雜質(zhì)

離心：高速離心（如12,000 rpm, 10分鐘），去除細(xì)胞碎片、基因組DNA和蛋白質(zhì)沉淀，上清含質(zhì)粒。

4. 質(zhì)粒純化

柱純化法（常用）：

•   - 上清通過硅膠膜吸附柱，質(zhì)粒DNA在離液鹽（如高濃度NaCl或鹽酸胍）條件下結(jié)合至膜上。
•   - 用洗滌液（如乙醇緩沖液）去除殘留雜質(zhì)。
•   - 用無核酸酶水或TE緩沖液洗脫質(zhì)粒。

酚氯仿抽提法（傳統(tǒng)方法）：

   用酚/氯仿抽提去除蛋白質(zhì)，乙醇沉淀質(zhì)粒DNA。

5. 質(zhì)粒檢測

• 濃度檢測：Nanodrop或Qubit測定濃度和純度（A???/A???比值應(yīng)接近1.8）。
• 電泳驗證：瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶（質(zhì)粒可能出現(xiàn)超螺旋、線性和開環(huán)三種形態(tài)）。
• 酶切驗證（可選）：用限制性內(nèi)切酶切割后電泳，確認(rèn)質(zhì)粒大小和結(jié)構(gòu)。

注意事項

• 防止降解：操作避免劇烈震蕩（尤其裂解后），減少剪切力。
• 去除RNA：確保緩沖液含RNase，避免RNA污染。
• 內(nèi)毒素去除（轉(zhuǎn)染實驗需注意）：可用特殊試劑盒或額外洗滌步驟。

不同試劑盒（如Qiagen、TIANGEN等）步驟可能略有差異，但核心原理相同。如需具體protocol，可根據(jù)實驗需求選擇相應(yīng)試劑盒或優(yōu)化方法。

真空純化系統(tǒng)在質(zhì)粒提取中的應(yīng)用

真空純化系統(tǒng)（Vacuum-based Purification System）是一種高效、高通量的核酸純化技術(shù)，廣泛應(yīng)用于質(zhì)粒DNA提取過程中，尤其適合中到大規(guī)模樣本處理（如96孔板形式）。其核心原理是通過負(fù)壓驅(qū)動溶液通過吸附膜（如硅膠膜），實現(xiàn)質(zhì)粒DNA的快速結(jié)合、洗滌和洗脫。

1. 真空純化系統(tǒng)的工作原理

1.  結(jié)合：裂解后的樣本（含質(zhì)粒DNA）在離液鹽（如鹽酸胍或高鹽緩沖液）存在下，通過負(fù)壓吸附至硅膠膜上，與雜質(zhì)（蛋白質(zhì)、基因組DNA、細(xì)胞碎片等）分離。  
2. 洗滌：在真空作用下，洗滌液（通常含乙醇）快速通過膜，去除殘留的鹽、代謝物和內(nèi)毒素。  
3. 洗脫：*后用無核酸酶水或低鹽緩沖液洗脫純化的質(zhì)粒DNA。

2. 在質(zhì)粒提取中的具體應(yīng)用步驟

以常見的真空純化試劑盒（如QIAGEN Plasmid Vacuum Kit）為例：  

1. 細(xì)菌裂解：  

   - 堿裂解法裂解細(xì)菌（Solution I/II/III處理）。  

2. 上樣至真空板：  

   - 將裂解液上清轉(zhuǎn)移至多孔真空純化板（如96孔板），板底部含硅膠膜。  

3. 真空抽濾：  

   - 連接真空泵，負(fù)壓使液體快速通過膜，質(zhì)粒DNA被捕獲，雜質(zhì)被濾除。  

4. 洗滌：  

   - 加入洗滌緩沖液，真空抽干去除殘留污染物。  

5. 洗脫：  

   - 加入洗脫緩沖液（如TE或水），關(guān)閉真空，靜置1-2分鐘使DNA溶解，*后收集洗脫液。

3. 優(yōu)勢

高通量：可同時處理多個樣本（如96孔板），適合大規(guī)模質(zhì)粒制備。  

快速：比傳統(tǒng)離心柱法節(jié)省時間（如30分鐘內(nèi)完成96個樣本）。  

自動化兼容：可與液體處理工作站聯(lián)用，減少人工操作。  

高純度：有效去除內(nèi)毒素、宿主DNA和RNA，適合轉(zhuǎn)染、測序等敏感實驗。  

4. 局限性

設(shè)備依賴：需真空泵或多孔板真空裝置。  

膜堵塞風(fēng)險：若樣本含過多雜質(zhì)（如未徹底裂解的菌體），可能降低流速。  

成本較高：相比常規(guī)離心柱法，真空板成本更高，適合大批量樣本。

5. 適用場景

高通量克隆篩選：如構(gòu)建文庫、突變體篩選。  

質(zhì)粒中提/大提：需快速獲得大量高純度質(zhì)粒（如病毒載體制備）。  

自動化平臺：整合至機器人液體處理系統(tǒng)，用于工業(yè)化生產(chǎn)。  

## **6. 對比其他純化方法**

| **方法**               | **通量**       | **速度**       | **純度**       | **適用規(guī)模**          |

|------------------------|---------------|---------------|---------------|-----------------------|

| **真空純化系統(tǒng)**       | 高（96孔板）  | 快（<30分鐘） | 高（低內(nèi)毒素）| 中到大樣本量          |

| **離心柱法**           | 低（單管）    | 中等（1小時） | 高            | 小到中樣本量          |

| **酚氯仿抽提法**       | 低            | 慢（2小時+）  | 中等          | 小樣本，低成本需求    |

7. 注意事項

裂解液處理：確保裂解完全，避免堵塞膜孔。  

真空壓力控制：壓力過高可能導(dǎo)致膜破損，過低則降低效率。  

洗脫優(yōu)化：適當(dāng)延長洗脫時間或加熱（65°C）可提高得率。  

真空純化系統(tǒng)在質(zhì)粒提取中極大提升了效率和一致性，尤其適合需要高通量、標(biāo)準(zhǔn)化操作的實驗室。選擇時需權(quán)衡成本、通量和設(shè)備條件。

注意：真空純化只有前面洗脫的步驟能代替離心機，*后的回收還要用離心機襯管收集。如下圖所示。