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胞外囊泡 （Extracellular Vesicles， EVs） 因其具有作為生物標志 （biomarker） 和*工具 （therapeutic tools） 的巨大潛力而在生物學和醫學領域日益受到關注。 然而，EVs 的異質性 （heterogeneity） 和復雜性也為新手帶來許多挑戰。
深入技術細節及詳情，請見專文：
? 從探索到驗證：為何需要“外泌體標準品”？
? 如何使用切向流過濾純化外泌體？
胞外囊泡 （Extracellular Vesicles， EVs） 是指從細胞釋放、由脂雙層膜包裹 （delimited by a lipid bilayer） 且無自我復制能力 （replicate） 的顆粒。 在早期研究中，將 EVs 依其生物起源 （biogenesis） 和尺寸 （size） 主要分為3大類：
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外泌體 (Exosomes) |
微囊泡 (Microvesicles) |
凋亡小體 (Apoptotic bodies) | |
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尺寸 |
40 ~ 120 nm |
100 ~ 1000 nm |
1000 ~ 5000 nm |
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生物起源 |
多囊體（MVB），透過內吞途徑 |
細胞膜，透過向外出芽 |
細胞膜，細胞凋亡過程 |
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標志& 組成 |
Tetraspanin (CD9, CD63, CD81), Alix, Tsg101, flotillin-1 |
Selectins, Integrins |
DNA, histones, cell organelles, Nuclear fractions, Annexin V. |
然而，國際胞外囊泡學會（ISEV）在MISEV2018及MISEV2023建議：若無明確的生物起源證據，優先采用作性命名，可依囊泡的物理特征、表面標志、細胞狀況或形態進行命名，如 sEV （小EVs）、lEV （大EVs） 及 CD63+ EV 等通用術語。
外泌體 （exosomes） 指源于胞內體系統 （endosomal system） 且經多囊體 （MVB） 釋放的 EVs; 惟在實務上難以直接證明起源，故在缺乏證據時不建議泛用此術語。 其常見報導尺寸約介于 40 ~ 120 nm間，常見標志為四跨膜蛋白 （tetraspanins），如 CD9、CD63、CD81 等。 外泌體可攜帶其親代細胞 （parent cell） 的核酸 （DNA、RNA）、脂質和蛋白質等分子訊息，并傳遞至受體細胞 （recipient cell） 調控其功能，影響多種生理功能及疾病進程，具強大的*潛力，故成為近年研究熱點。
EVs 研究涉及多個關鍵步驟，包含樣品準備到*后的分析和儲存各步驟都會影響EVs的品質。
目的：獲取含有 EVs 的原始生物材料，并盡早移除細胞及特定污染物。
材料：EVs 可從生物源獲取，如細胞培養液 （cell culture-conditioned medium）、細菌 （bacteria）、血液 （blood）、尿液 （urine） 、牛奶 （milk） 等。
通用建議：
請報告樣品來源、數量（如體積、重量）及采集的方法及儲存的所有細節。
? 從原始材料中盡早移除細胞，否則細胞破損可能形成類天然 EVs 的顆粒; 細胞死亡及活化也可能會改變 EVs 的組成和功能。
? 建議在樣本儲存之前先完成必要的前處理，以去除可能的干擾物質，如細胞。
? 樣品儲存可能對 EVs 產生影響，請避免反復凍融循環 （freeze‐thaw cycles）。
? 報告 EVs 分離前后的所有儲存條件，含防腐劑 （preservatives） 或冷凍劑 （cryoprotectants）、溫度、時間、冷凍程序、儲存容器、凍融循環次數和解凍方法。
* 本文僅列通用建議，針對各類樣品之個別建議，請查閱 MISEV2023
目的：從原始生物材料中分離 EVs、提高 EVs 濃度，同時盡可能減少非 EVs 成分 （如游離蛋白、脂蛋白、細胞碎片等） 的干擾。
純化方法：每種方法的回收率 （recovery） 及特異性 （specificity） 皆有所不同，應依據樣品的特性選擇不同的分離 （isolation） 或富集 （enrichment）方法，如差速離心法 （dUC）、密度梯度離心法 （DG， dgUC）、 超過濾法 （UF）、粒徑篩析層析法 （SEC）、沈淀法 （ precipitation） 等。
通用建議：
依據 EVs 的來源特性、研究目的以及所需的 EVs 產率和特異性來決定分離方法。
? 需要更高純度的 EVs 時，可考慮串聯兩種以上不同原理的純化方法
? 大體積材料來源可能需要先濃縮再分離會更有效率，如 CCM、尿液、牛奶。
? 針對市售商業套組，應優先選擇公開分離原理及成分細節的套組。
? 所有 EV 分離方法皆建議提供純度與回收率佐證。
? 提供足夠的方法細節以利重現每個分離和濃縮步驟。
? 評估或建議新分離/濃縮方法時，請在每個步驟前/后對 EVs 進行測試，以估算其富集倍數 （fold enrichment） 及產量 （yield）。
延伸閱讀：如何使用切向流過濾純化外泌體？
目的：確認分離的顆粒是否為 EVs，可對其大小、濃度、形態和生物標志物進行分析，是驗證分離可靠性的關鍵步驟。
定量及表征方法：EVs 表征方法包含顆粒濃度、蛋白質含量、脂質含量、總 RNA 含量、EVs 形態、蛋白質組成等。
通用建議：
? EVs 表征應至少包含三個層面的信息：
（1） 特理與定量特性 （如顆粒濃度、粒徑分布），用以描述樣品的整體性質;
（2） EVs 標志物 （如跨膜蛋白、GPI 錨定蛋白、胞質或細胞膜來源蛋白），以確認樣品為 EVs;
（3） 非 EV 共分離成份 （non-EV proteins），用以評估樣品純度并區分非 EV 來源的污染物。
? 沒有單一的測量方法能夠滿足所有表征要求，建議使用檢測極限不同的正交法 （orthogonal methods） 進行測量。
? 報告所有分析方法的細節，包括儀器、參數和數據分析過程，以確保實驗的可重復性和透明度。
? 建議以生物源定義 EVs 的產量，如細胞的數量、生物體液體積、組織重量等。
? 應進行 EVs 的定量計算，如顆粒數量、蛋白質 （protein） 和/或脂質 （lipid） 含量。
? 應對 EVs 的通用成份或特定成份進行測試，尤其有特異性要求時，如 EVs 亞型 （EV subtypes）。
? 應根據希望達到的特異性對EV制劑進行測試，以確定是否存在與EV亞型或EV相關的成分。
? 需確定非囊泡 （non-vesicular）、共分離 （co-isolated） 成分的存在程度。
? 使用定量指標來表征 EVs 時，提供儀器及方法檢測極限 （LOD）。
?鼓勵使用標準品、陰性對照與多重檢測平臺交叉驗證
延伸閱讀：從探索到驗證：為何需要“外泌體標準品”？
目的：維持已分離 EVs 的完整性、功能和穩定性，以供后續實驗使用。 不當的儲存會影響 EVs 的特性 （characteristics），包括穩定性 （stability）、顆粒數量、聚集 （aggregation） 和功能 （function）。
通用建議：
報告 EVs 分離前后的所有儲存條件，含防腐劑 （preservatives） 或冷凍劑 （cryoprotectants）、溫度、時間、冷凍程序、儲存容器、凍融循環次數和解凍方法。
? 避免反復凍融循環 （freeze-thaw cycles），建議可分裝 （aliquoting） 使用。
? 建議快速冷凍及解凍樣品，以利*限度地保留 EVs 的形態和功能。
EVs 的復雜性常常讓新手陷入一些常見的陷阱
命名混淆
樣品污染：細胞培養的血清或補充劑常含有大量外源性 EVs 及其它因子。 進行 EVs 相關實驗時，務必去除內含 EVs 或直接使用無血清培養液，減少 EV 污染的可能性。
細胞干擾：搜集樣品后未能及時且徹底地移除細胞，死細胞或受損細胞則可能形成類天然 EVs 的顆粒、釋出胞內成份、改變 EVs 組成及功能，造成結果失真。
分離方法選擇不當：不同的分離方法有不同的回收率和純度及其優缺點。 應根據樣品類型、實驗目的及后續應用，選擇能夠提供足夠純度和回收率的純化方法。
表征不足：未充份表征或未檢測常見污染物 （如脂蛋白lipoprotein），不足以確認檢測物為 EVs 或導致實驗結論不可靠。 建議采用多種方法進行全面的表征。
儲存不當：反復凍融、溫度或儲存容器都可能導致 EVs 的完整性、濃度和功能受損。 務必嚴格遵循標準儲存流程并詳實記錄。
